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本试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素(Biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3'-OH末端，并可与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下，产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片或爬片)的凋亡原位检测。

1. 各个样本请用免疫组化笔做好标记，另外加2张样本切片分别用于阳性片和阴性片制备并做好标记。
   
2. 在每步反应或浸洗的间隙时，配制下一步即用的工作液。
   
3. 每步反应浸洗时间应充足，浸洗时间短可能会引起背景过高。
   
4. 反应液最好根椐计算好的样本数量集中配制，再分别滴加于各样本上，避免因每个样本单独配制而产生的试剂损耗，TdT酶反应液如需短暂保存时，请置于冰上。
   
5. 配制好的DAB工作液应为浅棕色，如颜色过深，请勿使用。
   
6. 操作请戴手套，防止试剂沾染皮肤，如有沾染请立即用大量清水冲洗。

1. 固定或前处理
   1. 细胞涂片或冷冻切片
      1. 将自然晾干的细胞样本(细胞涂片或爬片)或冷冻切片浸入盛有4%多聚甲醛固定液的染色
         缸，室温(15～25℃)固定20～30min；
         
      2. 样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
   2. 石蜡切片
      1. 切片按常规方法进行脱蜡，60℃烘片60min后，二甲苯脱蜡2次，乙醇水合(100%、95%、80%、75%)每次5min；
         
      2. 切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
2. 通透
   1. 细胞涂片或冷冻切片
      3. 配制1% Triton X-100通透液；例：99mL的1×PBS加入1.0mL Triton X-100，混匀，即用即配；
         
      4. 样本片浸入通透液中，室温促渗3～5min；之后浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
   2. 石蜡切片
      3. 样本浸泡于pH6.0的柠檬酸缓冲液中，微波中高火8分钟左右，再自然晾凉。
         
      4. 配制Proteinase K工作液：计算好样本数量集中配制，每样本90μL 1×PBS加入10μL 10×Proteinase K，即用即配；每个组织切片上滴加100μL Proteinase K工作液，37℃反应30min。切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
3. 封闭
   5. 配制3% H2O2封闭液；例：80mL甲醇加入10mL H2O和10mL H2O2(30%)，即用即配；
      
   6. 样本片浸入封闭液中，室温(15～25℃)封闭10min；
      
   7. 样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
4. 制阳性片
   
   8. 根据样本类型不同，配制100μL含不同活性单位U的DNaseⅠ反应液，方法如下：
      

      样本	细胞样本	冷冻切片	石蜡切片
      U/100μL	1000～2000U	2000～3000U	3000～5000U
      DNase I(50U/μl)用量	20～40μL	40～60μL	60～100μL
      DNase I Buffer用量	80～60μL	60～40μL	40～0μL

      
      注：阳性片只针对实验体系进行设置对照，不需要每片制备。
      
   9. 在一张样本上滴加100μL上述配制好的DNase I反应液，室温～37℃处理10～30min；
      
   10. 上述阳性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
5. 连接
   
   11. 配制TdT酶反应液：计算好样本数集中配制(阴性对照片不计)，每样本用量：20μL Equilibration Buffer加10μL ddH2O、2.0μL Biotin-11-dUTP和8.0μL TdT Enzyme，即用即配，注意避光；
       
   12. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加40μL TdT酶反应液，放入温盒中，37℃避光反应30～60min；
       注：阴性对照样本不加TdT酶反应液。
       
   13. 反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
6. 标记
   
   14. 配制Streptavidin-HRP工作液，计算好样本数量集中配制，每个样本用量为：49.5μL 1×PBS加入0.5μL Streptavidin-HRP，即用即配，注意避光；
       
   15. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片放入温盒中，37℃避光反应30min；
       
   16. 反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
7. 显色
   
   17. 配制DAB工作液:计算好样本数量集中配制，每个样本样本用量为：50μL dH2O加入2.5μL DAB -A Solution，混匀后再加入2.5μL DAB-B Solution和2.5μL DAB-C Solution，即用即配；
       
   18. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μL DAB工作液，室温显色反应30s～5min；
       
   19. 显色后的样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
8. 复染
   
   20. 苏木素、甲基绿等常规染液复染(自备试剂)：将样本上滴加苏木素染液，染色30s～5min(请在显微镜下观察确定)，蒸馏水冲洗干净后浸入1%盐酸甲醇溶液中分化5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸洗5min，用二甲苯浸二次，每次10min(细胞爬片或涂片可不经过梯度乙醇和二甲苯浸润)。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片，光学显微镜下观察拍照。

1. 石蜡样本：动物经4%多聚甲醛全身灌注后及时取材，样本转移至15、50mL密闭离心管中，4%多聚甲醛固定(组织必须完全浸没在固定液中)，室温存放24h以上，可长期保存，常温密封运输，封口膜封好，组织块不易过大过厚，一般2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度须保持在0.3cm以内(固定液现配使用)。
   
2. 冰冻样本：动物经4%多聚甲醛全身灌注后及时取材，4%多聚甲醛固定24h，30%蔗糖脱水48h以上，-20℃或-80℃冷冻(特殊组织特殊处理：如脑组织，需灌注后取材；眼球需用特殊固定液)。